1. Određivanje broja fertilnih zrnaca tla
Sterilnom pincetom položiti deset zrnaca zemlje na ploču s Ashby agarom. Ploče inkubirati na 26°C/72 h. Ako su se nakon razdoblja inkubacije razvile sjajne, sluzaste, prozirne nakupine, znak je da su u uzorku tla prisutne aerobne bakterije asimbiontski fiksatori dušika, koje prirodnim putem obogaćuju tlo dušikom.
2. Određivanje broja kolonija Azotobacter chroococcum u tlu
Pripremiti uzorak tla tako da se 1 g svježeg uzorka homogenizira u epruveti s 9 mL sterilne destilirane vode s dodatkom 0,3% NaCl. Napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Za uzgoj A. chroococcum po 0,1 mL iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja nacijepiti metodom širenja razmaza na ploče s Ashby agarom. Ploče inkubirati na 26°C/72 h. Nakon inkubacije brojiti sjajne, sluzaste, prozirne kolonije i izračunati broj kolonija po 1 mL tla.
3. Određivanje titra Clostridium pasteurianum u tlu
Pripremiti uzorak tla tako da se 1 g svježeg uzorka homogenizira u epruveti s 9 mL sterilne destilirane vode s dodatkom 0,3% NaCl. Napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Za uzgoj C. pasteurianum po 1,0 mL iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja nacijepiti u epruvete s dubokim Vinogradskim bujonom za uzgoj C. pasteurianum. Epruvete inkubirati na 37°C/72 h. Pozitivna reakcija prepoznaje se kao zamućenje na dnu epruvete i stvaranje mjehurića koji izlaze iz taloga na dnu epruvete. Nakon razdoblja inkubacije očitati titar C. pasteurianum u uzorku.
4. Negativno bojenje kapsula bakterije Azotobacter chroococcum
Pikirati pojedinačnu koloniju A. chroococcum poraslu na Ashby agaru, te pripremiti razmaz u kapljici tuša na predmetnom stakalcu. Obojiti prema uputama za bojenje bakterijskih kapsula (negativno bojenje) te mikroskopirati pod imerzijom. Stanice A. chroococcum diplokoki su obavijeni debelom kapsulom.
5. Bojenje spora bakterija Clostridium pasteurianum
Ostaviti epruvete s pozitivnom reakcijom na C. pasteurianum na produženoj inkubaciji 14 dana. Bakteriološkom ušicom uzeti uzorak iz dubine C. pasteurianum dubokog Vinogradski bujona pazeći da se ne podigne talog CaCO₃ u epruveti. Napraviti razmaz na predmetnom stakalcu. Obojiti prema uputama za bojenje spora po Schäfer-Fultonu te mikroskopirati pod imerzijom. Spore su smještene terminalno.
6. Određivanje postotka fiziološke skupine želatinolitičkih bakterija u populaciji ukupnih saprofitskih bakterija u vodi
Homogenizirati uzorak površinske vode u Winklerovoj boci energičnim mućkanjem. Napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Po 0,1 mL uzorka iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja nacijepiti metodom širenja razmaza na Pertijeve ploče s podlogama za uzgoj želatinolitičkih bakterija. Nakon inkubacije (22°C/72 h) prebrojiti na pločama sve kolonije te izračunati broj ukupnih saprofitskih bakterija po 1 mL vode. Nakapati otopinu HgCl₂ na ploče za uzgoj želatinolitičkih bakterija. Izbrojiti kolonije s okolnim prozirnim zonama te izračunati broj kolonija želatinolitičkih bakterija. Na osnovi broja kolonija ukupnih saprofitskih bakterija i broja kolonija proteolita izračunati postotak želatinolitičkih bakterija u populaciji ukupnih saprofitskih bakterija u uzorku.
7. Izolacija amonifikatora
Pripremiti decimalna razrjeđenja uzorka površinske vode, inokulirati sterilne podloge za dokazivanje stvaranja amonijaka iz proteina s 1 mL odgovarajućeg razrjeđenja te inkubirati 10 dana/22°C. Ako bakterije iz proteina stvaraju amonijev ion, boja se indikatora promijeni iz narančaste u purpurnu. Na osnovi broja pozitivnih epruveta odrediti titar amonifikatora u uzorku vode.
8. Amonifikacijska aktivnost
Po 50 mL uzorka površinske vode uliti u sterilne Erlenmayerove tikvice i dodati 5 mL tekućeg medija (Rheinheimer), promiješati i inkubirati na 22°C. Obvezno pripremiti i kontrolnu tikvicu s podlogom Rheinheimer bez dodavanja uzorka vode. Svaka 24 h u tikvicama izmjeriti koncentracije stvorenog amonijeva iona. Koncentracija amonijeva iona mjeri se na spektrofotometru nakon dodatka komercijalnih reagenasa. Klasična metoda dokazivanja amonijeva iona podrazumijeva dodatak Nesslerova reagensa, pri čemu se u prisutnosti amonijeva iona razvija narančastosmeđa boja. Amonifikacijska se aktivnost izražava u mg stvorenog amonijeva iona u određenom vremenu (npr. 4,2 mg/L NH₄⁺/48 h).
9. Određivanje aktivnosti fiziološke grupe nitrifikatora prve faze u Vinogradski I. bujonu
Homogenizirati uzorak otpadne vode u Winklerovoj boci energičnim mućkanjem. Nacijepiti po 20 mL uzorka u dvije Erlenmeyerove tikvice s 200 mL bujona Vinogradski I. U jednu tikvicu uroniti pumpu za aeraciju i pustiti da aerira podlogu cijelo vrijeme pokusa. Drugu tikvicu ostaviti bez aeracije. Izmjeriti početnu koncentraciju amonijeva iona i nitrita u podlogama. Inkubirati tikvice na sobnoj temperaturi 8 dana i kontrolirati svaki dan koncentraciju amonijeva iona i nitrita. Koncentracija amonijeva iona i nitrita mjeri se na spektrofotometru nakon dodatka komercijalnih reagenasa. Klasična metoda dokazivanja amonijeva iona podrazumijeva dodatak Nesslerova reagensa, pri čemu se u prisutnosti amonijeva iona razvija narančastosmeđa boja. Klasična metoda dokazivanja nitrita podrazumijeva dodatak Griess-Ilosvayeva reagensa, pri čemu se u prisutnosti nitrita razvija crvenoroza boja. Rezultate izraziti kao nitritacijski potencijal ispitivane vode u mg stvorenog nitrita u određenom vremenu (npr. 0,015 mg/L NO₂⁻/48 h).
10. Određivanje aktivnosti fiziološke skupine nitrifikatora druge faze u Vinogradski II. bujonu
Homogenizirati uzorak otpadne vode u Winklerovoj boci energičnim mućkanjem. Nacijepiti po 20 mL uzorka u Erlenmeyerove tikvice s 200 mL steriliziranog bujona Vinogradski II. U jednu tikvicu uroniti pumpu za aeraciju i pustiti da aerira podlogu cijelo vrijeme pokusa. Drugu tikvicu ostaviti bez aeracije. Izmjeriti početnu koncentraciju nitrita i nitrata u podlogama. Inkubirati tikvice na sobnoj temperaturi 8 dana i kontrolirati svaki dan koncentraciju nitrita i nitrata. Koncentracija nitrita i nitrata mjeri se na spektrofotometru nakon dodatka komercijalnih reagenasa ili pomoću komercijalnih testnih trakica za dokazivanje nitrata i nitrita (slika 78). Rezultate izraziti kao nitritacijski potencijal ispitivane vode u mg stvorenog nitrata u određenom vremenu (npr. 3,7 mg/L NO₃⁻/48 h).
11. Određivanje najvjerojatnijeg broja denitrifikatora u vodi
Homogenizirati uzorak otpadne vode u Winklerovoj boci energičnim mućkanjem. Nacijepiti duboki Giltayev bujon s Durhamovom epruvetom u epruvete s odgovarajućim decimalnim razrjeđenjima uzorka vode. Inkubirati epruvete 8 dana/22°C. Kao znak denitrifikacije uzima se promjena zelene boje indikatora u plavu te mjehurić plina u Durhamovoj epruveti. Prema tablicama po McCradyu ili GOST-u izračunati najvjerojatniji broj denitrifikatora u uzorku vode.