Pregled vježbi
Ovo poglavlje uključuje praktične vježbe vezane uz biogeokemijski ciklus sumpora i ulogu mikroorganizama u transformacijama sumpora.
🔬 Tipovi vježbi:
1. Određivanje broja kolonija proizvođača sumporovodika iz proteina
Homogenizirati uzorak mulja površinske vode (jezerskog ili riječnog) u epruveti energičnim mućkanjem. Razrijediti 1 g mulja s 9 mL sterilne destilirane vode s dodatkom 0,3% NaCl te napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Po 0,1 mL uzorka iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja nacijepiti metodom širenja razmaza na Petrijeve ploče s Pepton-amonij citrat agarom (PCA). Inkubirati 3 dana/26°C, izbrojiti kolonije s crnim središnjim dijelom i izračunati broj kolonija bakterija proizvođača sumporovodika iz proteina u 1 g mulja.
🧪 Pozitivna reakcija: Crne kolonije zbog FeS taloga
2. Određivanje broja kolonija sulfit reducirajućih klostridija
Homogenizirati uzorak mulja površinske vode u epruveti energičnim mućkanjem. Razrijediti 1 mL mulja s 9 mL sterilne destilirane vode s dodatkom 0,3% NaCl te napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Po 1 mL uzorka iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja odpipetirati u sterilne epruvete. Na uzorke u epruvetama naliti 10 mL sterilnog toplog (održavan u termostatu na 56°C) SPS agara. Nakon izlijevanja podloge epruvete uroniti odmah u hladnu vodu i pustiti da se podloga skrutne. Inkubirati epruvete na 35°C/24-48 h. Nakon inkubacije prebrojiti ovalne crne kolonije u epruvetama te izračunati broj kolonija sulfit reducirajućih klostridija u 1 g mulja.
🦠 Rezultat: Crne ovalne kolonije Clostridium u dubini agara
3. Određivanje najvjerojatnijeg broja sulfat/tiosulfat reducirajućih bakterija
Homogenizirati uzorak mulja površinske vode u epruveti energičnim mućkanjem. Nacijepiti sterilnom iglom i špricom 1 mL originalnog uzorka u prvu bočicu sa STM podlogom (9 mL podloge). Novom sterilnom iglom i špricom nacijepiti iz prve nacijepljene bočice sa STM podlogom 1 mL uzorka u iduću bočicu. Tako se nacijepe bočice u seriji decimalnih razrjeđenja bez razrjeđivanja uzorka u sterilnoj destiliranoj vodi. Nacijepljene bočice staviti na inkubaciju (28°C/36 h). Nakon inkubacije očitati broj pozitivnih bočica, što se vidi kao zacrnjenje u bočici. Odrediti titar sulfat/tiosulfat reducirajućih bakterija te izračunati prema tablicama po McCradyju ili GOST-u najvjerojatniji broj bakterija po 1 g mulja.
🧬 Pozitivna reakcija: Crno obojavanje zatvorenih bočica
4. Bojenje fiziološke skupine sulfat/tiosulfat reducirajućih bakterija po Gramu
U prvoj pozitivnoj bočici promiješati sadržaj i uzeti špricom uzorak te napraviti razmaz na predmetnom stakalcu. Obojiti prema uputama za bojenje po Gramu te mikroskopirati pod imerzijom. Vibrioidni svrnuti štapići najvjerojatnije su bakterije roda *Desulfovibrio*, ali i drugi su oblici su vrste fiziološke skupine sulfat reducirajućih bakterija.
🔬 Rezultat: Morfološka karakterizacija sulfat reducirajućih bakterija