Vježba 3.6 - Bojenje acidorezistentnih bakterija po Ziehl-Neelsenu

Za bojenje u praktikumskoj nastavi preporučuje se primjena nepatogenih mikobakterija, kao što je Mycobacterium phei (Slika 23). Mycobacterium phei uzgaja se na selektivnoj Lowenstein-Jensenovoj hranjivoj podlozi na 37°C/72 h.

Medij se sterilizira 30 min na 121°C, ohladi do 30°C i doda mješavina svježih jaja. Potrebna je 1L mješavine svježih jaja, ne starijih od 1 tjedan (20-25 jaja). Jaja se miješaju u prethodno steriliziranoj posudi. Za bojenje acidorezistentnih bakterija prva boja karbol fuksin nanese se preko razmaza fiksirane bakterijske kulture. Pridržavajući predmetno stakalce pincetom, preparat se zagrijava s donje strane iznad plamena dok boja ne počne isparavati (oko 15 sek), a potom se odmakne u stranu da se ohladi. Nakon otprilike minutu zagrijavanje se ponavlja još dva puta (trokratno zagrijavanje). Zagrijani karbol fuksin prodire kroz voštani omotač acidorezistentne bakterije. Nakon zagrijavanja preparat se ispere kiselim alkoholom sve dok ne prestane izlaziti crvena boja, a djelovanje alkohola prekida se ispiranjem pod mlazom vode. Kao kontrastno bojilo upotrebljava se metilensko modrilo koje će, naneseno preko razmaza obojiti stanice koje nisu acidorezistentne. Preparat se opet opere mlazom vode iz vodovoda, posuši i mikroskopira. U preparatu vidjet će se crveno obojene acidorezistentne bakterije (slika 24).