Direktne metode brojenja
Metode direktnog određivanja broja bakterija obuhvaćaju brojenje pod mikroskopom ukupnog broja živih i mrtvih bakterija u suspenziji. Broj stanica u poznatom volumenu suspenzije određuje se u Petroff-Hauserovoj komorici za brojenje bakterija (slika 47). Ukupan volumen zatvoren u Petroff-Hauserovoj komorici iznosi 0,02 mm³, jer je mrežica površine 1 mm², a dubina komorice 0,02 mm.
Za brojenje stanica kvasaca i spora plijesni upotrebljava se Thomina komorica ili Bürker-Türkova komorica volumena 0,1 mm³.
Napomena: Budući se se brojenjem u komorici ne može ustanoviti koje su bakterije žive, a koje nisu, dobiveni je broj u pravilu veći no što je stvaran broj živih stanica u uzorku. Metoda određivanja ukupnog broja bakterija primjenjuje se radi brze procjene broja bakterija u kontroli kvalitete namirnica, kod infekcija mokraćnog sustava i u ekološkim studijama.
Moderne metode direktnog brojenja
Modernije metode direktnog brojenja bakterija obuhvaćaju epifluorescentnu mikroskopiju i bojenja bakterija fluorescentnim bojama kao što su akridin oranž i DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol).
Bojenje akridin oranžom
Bakterije u uzorku vode ili razrijeđenom uzorku volumena 2 mL boje se 2 min u sustavu za membransku filtraciju 0,1%-tnom otopinom akridin oranža. Konačna koncentracija boje u ovako obojenom uzorku bude 10 μg/mL.
Bojenje DAPI-em
Ako se kao fluorescentna boja koristi DAPI, bakterije se boje 5 min 0,0001%-tnom otopinom DAPI-a, tako da je konačna koncentracija boje u uzorku 0,01 μg/mL.
Filtracija i priprema
Poslije bojenja uzorak se filtrira kroz crni polikarbonatni filtar, npr. Nuclepore, promjera pora 0,2 μm. Ako je filtar bijel, poželjno ga je prije filtracije obojiti u crno, što je potrebno radi postizanja kontrasta kod epifluorescencije.
Bojenje filtra
Filtar se boji u crno stajanjem filtra u Irgalan crnilu (1g Irgalan crnila u 1L 1%-tne octene kiseline) 24 h.
Brojenje pod mikroskopom
Bojenje akridin oranžom
Na filtru sakupljene bakterije obojene akridin oranžom broje se u plavom svjetlu (450-490 nm) pod imerzijskim objektivom (povećanje 1000 x), uz uporabu imerzioskog ulja oslobođenog autofluorescencije. Broje se jasno ocrtani oblici zelene i narančaste boje.
Bojenje DAPI-em
Bakterije obojene DAPI-em broje se u UV-svjetlu (270-380 nm), kao jasno ocrtani oblici plave boje.
Postupak brojenja
U vidnom polju mikroskopa omeđenom okularnom mrežicom pregleda se najmanje 10 polja, a broj ukupnih bakterija u 1 mL uzorka izračuna se prema jednadžbi:
Broj bakterija/mL = (srednji broj bakterija × površina filtra (μm²)) / (volumen uzorka (mL) × površina polja (μm²))
