Prethodni test

🔬

Postupak

Prethodnim testom dokazuje se u vodi prisutnost bakterija koje fermentiraju laktozu na 35,0±0,5°C/48 h ili na 44,5±0,2°C/24 h i najvjerojatnije su koliformi. Za izvedbu prethodnog testa (slika 52) najprije je potrebno napraviti seriju decimalnih razrjeđenja uzorka. Najprije se 1 mL originalnog uzorka iz Winklerove boce sterilno prenese u epruvetu s 9 mL sterilne destilirane vode s dodatkom 0,3% NaCl. Uzorak u prvoj epruveti bit će razrijeđen 10 puta (1:10 ili 10⁻¹, 1:100 ili 10⁻² itd). Nakon homogeniziranja sadržaja epruvete, promijeniti pipetu i prebaciti 1 mL u iduće epruvete. Na kraju ćemo dobiti razrijeđeni uzorak u epruvetama za po 10 puta, zbog čega ovako pripremljenu seriju epruveta nazivamo serijom decimalnih razrjeđenja uzorka. Potom nacijepiti po 1 mL uzorka iz odgovarajuće serije decimalnog razrjeđenja u epruvete s npr. MacConkeyevim bujonom.

Od brojnih komercijalnih medija najčešće se rabi MacConkeyev bujon. MacConkeyev je bujon selektivna podloga koja omogućuje rast koliformnih bakterija, a rast Gram-pozitivnih bakterija inhibiran je žučnim solima i brom krezol purpurnim. Brom-krezol purpurno sadržano u Mac-Conkeyevu bujonu je u neutralnom pH purpurno-ljubičaste boje, a kod pH 5,2 žute. Ako bakterije u epruveti fermentiraju laktozu do miješanih kiselina i CO₂, pH u epruveti će pasti na 5,2 pri čemu će boja pH-indikatora prijeći iz ljubičaste u žutu, a u maloj Durhamovoj epruveti vidjet će se mjehurić plina CO₂ (slika 53). Da bi se rezultat označio kao pozitivan, barem 1/3 Durhamove epruvete mora biti ispunjena plinom.

🧪

Sastav MacConkey bujona

Žučne soli 5,0 g

Pepton 20,0 g

Laktoza 10,0 g

NaCl 5,0 g

Brom krezol purpurno 0,01 g

Destilirana voda 1000 mL

pH = 7,4 ± 0,2

Slika 53 Pozitivna (desno) i negativna (lijevo) reakcija na koliformne bakterije u epruveti s MacConkeyevim bujonom

🧮

Izračunavanje najvjerojatnijeg broja ukupnih i fekalnih koliformnih bakterija

Titar je najmanji volumen ili najveće razrjeđenje uzorka u kom još možemo dokazati prisutnost tražene skupine ili vrste bakterija. Ako je npr. zadnja pozitivna reakcija dobivena u epruveti s nacijepljenim 10⁻³ mL, titar će biti 10⁻³ ili 0,001 mL.

Tablice po McCradyju objavljene u Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (2005.) (tablica 3) služe za izračunavanje najvjerojatnijeg broja bakterija iz očitanog titra. Kako bismo tablice mogli koristiti, isti volumen uzorka treba biti nacijepljen po tri ili pet puta. Nakon očitavanja titra dobivamo kombinaciju pozitivnih reakcija. U produžetku tablice na osnovi dobivene kombinacije očita se najvjerojatniji broj bakterija (engl. Most Probable Number, MPN) po 100 mL uzorka.

Primjer:

Ako je nacijepljeno u epruvete 10, 1 i 0,1 mL s tri ponavljanja, a s nacijepljenih 10 mL u sve tri epruvete dobivena pozitivna reakcija, s nacijepljenih 1 mL u dvije epruvete dobivena pozitivna reakcija, a s nacijepljenih 0,1 mL u jednoj epruveti dobivena pozitivna reakcija, dobivamo kombinaciju 3-2-1. U produžetku tablice vidimo da to odgovara najvjerojatnijem broju bakterija 150/100 mL.

📊

Tablica po McCradyju

Tablica po McCradyju služi za izračunavanje najvjerojatnijeg broja (MPN) koliformnih bakterija na temelju pozitivnih i negativnih reakcija u različitim razrjeđenjima.

Kako koristiti tablicu:

1. Zabilježite broj pozitivnih epruveta za svako razrjeđenje
2. Pronađite odgovarajući redak u tablici
3. Očitajte MPN vrijednost za 100 mL
4. Pomnožite s odgovarajućim faktorom za vaš volumen

Pozitivne epruvete			MPN / 100 mL		Pozitivne epruvete			MPN / 100 mL
10 mL	1,0 mL	0,1 mL	3 pon.	5 pon.	10 mL	1,0 mL	0,1 mL	3 pon.	5 pon.
0	0	0	< 3	< 2	4	1	1	-	21
0	0	1	3	2	4	1	2	-	26
0	1	0	3	2	4	2	0	-	22
0	2	0	6	4	4	2	1	-	26
1	0	0	4	2	4	3	0	-	23
1	0	1	7	5	4	3	1	-	28
1	1	0	7	5	4	3	2	-	28
2	0	0	9	6	4	3	3	-	30
2	0	1	14	9	4	4	0	-	25
2	1	0	15	10	4	4	1	-	26
3	0	0	23	15	4	4	2	-	27
3	0	1	39	26	4	4	3	-	28
3	1	0	43	29	4	4	4	-	29
3	1	1	75	50	4	4	4	-	30
3	2	0	93	62	4	4	4	-	31
3	2	1	150	100	4	4	4	-	32
3	3	0	210	140	4	4	4	-	33
3	3	1	290	190	4	4	4	-	34
3	3	2	390	260	4	4	4	-	35
3	3	3	>1600	>1100	4	4	4	-	36

Objašnjenje:

MPN = najvjerojatniji broj bakterija (Most Probable Number)

3 pon. = tri serije ponavljanja

5 pon. = pet serija ponavljanja

📋

Tablice po GOST-u

Tablice po GOSTU-u (Gospodarski državni standardi Rusije, tablica 4) služe za izračunavanje koli-indeksa i koli-titra iz očitanog titra ako je određeni volumen uzorka nacijepljen samo jedan put, bez ponavljanja.

Koli-indeks najvjerojatniji je broj bakterija / 1000 mL, a koli-titar najmanji volumen uzorka izražen u mL u kom još možemo naći tražene bakterije. Tablice se koriste tako da uzmemo u obzir rang nacijepljenih volumena iz serije decimalnog razrjeđenja pa u epruvetama imamo kombinaciju pozitivnih i negativnih reakcija.

Primjer:

Ako je pozitivna reakcija dobivena u epruvetama s nacijepljenim 10, 1 i 0,1 mL, a kod viših razrjeđenja reakcija je bila negativna, koristimo se tablicom koja u gornjem lijevom uglu počinje s 10 mL. Kod kombinacije +++- koli-indeks bit će 23800 / 1000 mL, a koli-titar 0,04 mL.

📋 Tablica za 10 mL, 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL

10 mL	1 mL	0,1 mL	0,01 mL	Koli-indeks	Koli-titar
-	-	-	-	<90	>11,1
-	-	-	+	90	11,1
-	-	+	-	90	11,1
-	+	-	-	95	10,5
-	-	+	+	180	5,6
-	+	-	+	190	5,3
-	+	+	-	220	4,6
+	-	-	-	230	4,3
-	+	+	+	280	3,6
+	-	-	+	920	1,1
+	-	+	-	940	1,0
+	-	+	+	1 800	0,6
+	+	-	-	2 300	0,4
+	+	-	+	9 600	0,1
+	+	+	-	23 800	0,04
+	+	+	+	>23 800	<0,01

📋 Tablica za 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL, 0,001 mL

1 mL	0,1 mL	0,01 mL	0,001 mL	Koli-indeks	Koli-titar
-	-	-	-	<900	>1,11
-	-	-	+	900	1,11
-	-	+	-	900	1,11
-	+	-	-	950	1,05
-	-	+	+	1 800	0,55
-	+	-	+	1 900	0,53
-	+	+	-	2 200	0,46
+	-	-	-	2 300	0,43
-	+	+	+	2 800	0,36
+	-	-	+	9 200	0,11
+	-	+	-	9 400	0,11
+	-	+	+	18 000	0,06
+	+	-	-	23 000	0,04
+	+	-	+	96 000	0,01
+	+	+	-	238 000	0,004
+	+	+	+	>238 000	<0,001

📋 Tablica za 10 mL, 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL (treća tablica)

10 mL	1 mL	0,1 mL	0,01 mL	Koli-indeks	Koli-titar
-	-	-	-	<9 000	>1,1
-	-	-	+	9 000	1,11
-	-	+	-	9 000	1,10
-	+	-	-	9 500	1,05
-	-	+	+	18 000	0,56
-	+	-	+	19 000	0,53
-	+	+	-	22 000	0,46
+	-	-	-	23 000	0,43
-	+	+	+	28 000	0,36
+	-	-	+	92 000	0,11
+	-	+	-	94 000	0,10
+	-	+	+	180 000	0,06
+	+	-	-	230 000	0,04
+	+	-	+	960 000	0,01
+	+	+	-	2 380 000	0,004
+	+	+	+	>2 380 000	<0,001

📋 Tablica za 0,01 mL, 0,001 mL, 0,0001 mL, 0,00001 mL

0,01 mL	0,001 mL	0,0001 mL	0,00001 mL	Koli-indeks	Koli-titar
-	-	-	-	<90 000	>0,0111
-	-	-	+	90 000	0,0111
-	-	+	-	95 000	0,0111
-	+	-	-	90 000	0,0105
-	-	+	+	180 000	0,0056
-	+	-	+	190 000	0,0053
-	+	+	-	220 000	0,0046
+	-	-	-	230 000	0,0043
-	+	+	+	280 000	0,0036
+	-	-	+	920 000	0,0011
+	-	+	-	940 000	0,0010
+	-	+	+	1 800 000	0,0006
+	+	-	-	2 300 000	0,0004
+	+	-	+	9 600 000	0,0001
+	+	+	-	23 800 000	0,00004
+	+	+	+	<100 000 000	>0,0001

📋 Tablica za 0,001 mL, 0,0001 mL, 0,00001 mL, 0,000001 mL

0,001 mL	0,0001 mL	0,00001 mL	0,000001 mL	Koli-indeks	Koli-titar
-	-	-	-	<900 000	>0,0111
-	-	-	+	900 000	0,0111
-	-	+	-	900 000	0,0111
-	+	-	-	950 000	0,0105
-	-	+	+	1 800 000	0,0056
-	+	-	+	1 900 000	0,0053
-	+	+	-	2 200 000	0,0046
+	-	-	-	2 300 000	0,0043
-	+	+	+	2 800 000	0,0036
+	-	-	+	9 200 000	0,0011
+	-	+	-	9 400 000	0,0010
+	-	+	+	18 000 000	0,0006
+	+	-	-	23 000 000	0,0004
+	+	-	+	96 000 000	0,0001
+	+	+	-	238 000 000	0,00004
+	+	+	+	>1 000 000 000	<0,00001

Postupak

Sastav MacConkey bujona

Izračunavanje najvjerojatnijeg broja ukupnih i fekalnih koliformnih bakterija

Primjer:

Tablica po McCradyju

Kako koristiti tablicu:

Objašnjenje:

Tablice po GOST-u

Primjer:

📋 Tablica za 10 mL, 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL

📋 Tablica za 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL, 0,001 mL

📋 Tablica za 10 mL, 1 mL, 0,1 mL, 0,01 mL (treća tablica)

📋 Tablica za 0,01 mL, 0,001 mL, 0,0001 mL, 0,00001 mL

📋 Tablica za 0,001 mL, 0,0001 mL, 0,00001 mL, 0,000001 mL

Brza navigacija

Započni učenje?